OTSRC?——一種?硒增強的單管重組酶聚合酶擴增（Se-RPA）-CRISPR/Cas12a檢測平臺?
宮頸癌作為女性系統(tǒng)高發(fā)惡性腫瘤，其防控意義遠(yuǎn)超疾病本身。重慶大學(xué)、四川大學(xué)等機構(gòu)的研究團隊開發(fā)了一種硒增強的單管重組酶聚合酶擴增（Se-RPA）-CRISPR/Cas12a檢測平臺，命名為<span style="text-indent: 2em;" data-pm-slice="1 1 ["para",{"tagName":"section","attributes":{},"namespaceURI":""}]">OTSRC，用于人乳頭瘤病毒16型（HPV 16）DNA的超靈敏、低背景噪聲檢測。該平臺旨在解決傳統(tǒng)等溫擴增中存在的非特異性擴增問題，為宮頸癌篩查提供一種快速、高靈敏、高特異性的即時檢測（POCT）方案。
1.靶標(biāo)基因：針對HPV 16型高度保守的 L1基因的部分序列進(jìn)行檢測。
在傳統(tǒng)的RPA反應(yīng)體系中，摻入10%的硒修飾核苷酸三磷酸（dNTPαSe），替代部分普通dNTPs。
o抑制非特異性擴增：dNTPαSe能競爭性抑制普通dNTPs的摻入，有效抑制引物非依賴的DNA從頭合成，從而降低背景噪聲。
o提高保真度：硒原子較大的原子半徑降低了DNA雙鏈的熱穩(wěn)定性，并降低了DNA聚合酶的結(jié)合親和力。這為聚合酶提供了更長的“校對”時間，使其能更有效地識別并糾正錯配的引物和錯誤摻入的核苷酸，從而提高擴增的準(zhǔn)確性和特異性。
采用創(chuàng)新的單管物理分隔設(shè)計：將Se-RPA反應(yīng)體系置于管蓋，CRISPR/Cas12a檢測體系置于管底。
第一步（37°C, 10分鐘）：進(jìn)行Se-RPA擴增，生成硒修飾的雙鏈DNA（dsDNA）產(chǎn)物。
第二步（離心混合）：通過離心將管蓋的RPA擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至管底，與CRISPR體系混合。
第三步（37°C, 10分鐘）：擴增產(chǎn)物激活Cas12a的反式切割活性，切割熒光報告探針（FAM標(biāo)記），釋放熒光信號。
優(yōu)勢：該設(shè)計實現(xiàn)了真正的單管封閉反應(yīng)，極大降低了氣溶膠污染風(fēng)險，簡化了操作。
其中，使用了沃博生物（warbio）的產(chǎn)品，CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條，貨號JY0301。
1.體系構(gòu)建與驗證：首先構(gòu)建了傳統(tǒng)的兩步法RPA-CRISPR（TSRC）和單管RPA-CRISPR（OTRC）體系作為對比。通過熒光強度和聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）驗證了OTSRC體系的可行性，證明dNTPαSe的加入能顯著降低背景信號（OTSRC的背景信號僅為OTRC的71.77%），同時產(chǎn)生硒修飾的擴增產(chǎn)物。
2.關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化：
dNTP濃度：確定20 μM為OTRC體系中的最佳dNTP濃度。
dNTPαSe比例：確定10% 為OTSRC體系中dNTPαSe的最佳體積百分比。
反應(yīng)溫度與時間：優(yōu)化后確定Se-RPA和CRISPR反應(yīng)均在37°C下進(jìn)行10分鐘，總反應(yīng)時間約20分鐘。
1.靈敏度：
OTSRC：檢測限（LOD）低至 169 aM（阿摩爾，約10?¹? 摩爾），線性范圍為100 aM 至 1 μM。
OTRC：檢測限為340 aM，線性范圍為1 fM 至 100 nM。
結(jié)論：OTSRC的靈敏度是OTRC的兩倍，且與金標(biāo)準(zhǔn)方法實時熒光定量PCR（qPCR） 的檢測效果相當(dāng)（qPCR檢測限為100 aM）。
結(jié)論：OTSRC的視覺檢測靈敏度比OTRC高一個數(shù)量級?？梢暬瘷z測的靈敏度比熒光檢測低4-5個數(shù)量級，主要歸因于固相輸出端的信號損失。
OTSRC與OTRC結(jié)合側(cè)流層析試紙條（LFA）檢測10 fM ~ 10 μM HPV DNA
2.特異性：使用四種非特異性DNA序列（濃度100 nM）進(jìn)行測試。結(jié)果顯示，僅HPV 16 DNA能產(chǎn)生高熒光信號，其他DNA的信號與背景無差異。LFA測試也顯示僅HPV DNA能在檢測線（T線）產(chǎn)生紅色條帶。證明了OTSRC和OTRC均具有優(yōu)異的選擇性。
熒光檢測：OTSRC和OTRC的重復(fù)性實驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為 4.589% 和3.793%，表明重復(fù)性良好。
LFA檢測：多次測試結(jié)果一致，顯示良好的再現(xiàn)性。
4.實際樣本檢測（抗干擾能力）：將HPV 16 DNA加入20倍稀釋的人血清中進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。
OTSRC：回收率在81.28% 至 107.1% 之間，RSD在 1.087% 至 3.457% 之間。
OTRC：回收率在94.91% 至 134.9% 之間，RSD在 1.350% 至 4.732% 之間。
結(jié)論：OTSRC在復(fù)雜生物基質(zhì)中表現(xiàn)出更優(yōu)的準(zhǔn)確度和精密度，具備臨床檢測潛力。
1.超低背景噪聲與高靈敏度：通過引入dNTPαSe，首創(chuàng)性地將硒化學(xué)修飾與RPA-CRISPR系統(tǒng)結(jié)合，顯著抑制了非特異性擴增，將檢測背景噪聲降低至傳統(tǒng)體系的71.77%，并將靈敏度提升了一倍。
2.高保真度與特異性：dNTPαSe增強了DNA聚合酶的“校對”能力，結(jié)合CRISPR/Cas12a序列特異性識別的雙重驗證機制，確保了檢測的極高準(zhǔn)確性。
3.快速單管封閉式操作：整個檢測流程僅需約20分鐘，且在恒溫37°C下完成。創(chuàng)新的單管物理分隔設(shè)計避免了開蓋操作，極大降低了污染風(fēng)險，適合現(xiàn)場應(yīng)用。
4.經(jīng)濟高效：反應(yīng)總體積僅14 μL，僅使用試劑盒推薦標(biāo)準(zhǔn)體積的五分之一，成本低廉。
5.雙模式輸出：兼容實驗室高靈敏熒光定量和現(xiàn)場可視化試紙條判讀，應(yīng)用靈活。
本研究成功構(gòu)建了一種基于硒增強RPA與CRISPR/Cas12a集成的OTSRC檢測平臺。該平臺實現(xiàn)了對HPV 16 DNA的超靈敏（169 aM）、快速（20分鐘）、高特異性、低背景噪聲的檢測，其性能與qPCR相當(dāng)，為宮頸癌的早期篩查，特別是在資源有限地區(qū)，提供了一種極具前景的POCT工具。
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貨號
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產(chǎn)品
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規(guī)格
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TABAS03KIT
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TwistAmp Basic Kit DNA擴增試劑盒
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96T
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TAEXO02KIT
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TwistAmp exo 試劑盒
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96T
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B8201C1
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DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA基礎(chǔ)型）
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48T
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B8202C3
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DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA熒光型）
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48T
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B8203C5
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DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA試紙條型）
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48T
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B8204C7
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RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA基礎(chǔ)型）
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48T
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B8205C9
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RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA熒光型）
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48T
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B8206C0
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RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA試紙條型）
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48T
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JY0209
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雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）
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50T
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JY0201
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單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）
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50T
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JY0307
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CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條
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50T
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JY0301
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CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條
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50T
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JY0308
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CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍）
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50T
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