核糖核酸（縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種，即A（腺嘌呤）、G（鳥嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶），其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T（胸腺嘧啶）。核糖核酸在體內(nèi)的作用主要是引導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。
RNA是由磷酸二酯鍵連接的核糖核苷酸組成的核酸。與DNA不同，RNA含有核糖，其2'位有一個羥基，這使得RNA更容易水解和降解。RNA中發(fā)現(xiàn)的四種堿基是腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)，其中尿嘧啶取代了DNA中的胸腺嘧啶。RNA以多種形式存在，每種形式具有不同的功能：
●mRNA（信使RNA）：攜帶遺傳信息從DNA到核糖體，在那里被翻譯成蛋白質(zhì)。
●rRNA（核糖體RNA）：構(gòu)成核糖體的核心結(jié)構(gòu)和催化成分，核糖體是負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞機器。
●tRNA（轉(zhuǎn)移RNA）：在蛋白質(zhì)合成過程中將特定的氨基酸轉(zhuǎn)移到核糖體。
●非編碼RNA（ncRNA）：包括微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）和小核仁RNA（snoRNA），它們在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)作用。
我們研究RNA，絕大多數(shù)是研究mRNA即信使RNA，信使RNA有什么特點呢？
信使RNA是RNA的一種，主要功能是將DNA上的遺傳信息傳遞到蛋白質(zhì)合成機器——核糖體上，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的。信使RNA的結(jié)構(gòu)簡單，一般由一條單鏈RNA組成。mRNA的長度差異較大，
哺乳動物的mRNA長度一般在5×102～1×105個核苷酸，這種長度的差異使得mRNA能夠攜帶更多的遺傳信息。
mRNA的壽命相對較短，它們在完成遺傳信息的傳遞任務(wù)后，就會被降解。這種短暫的壽命保證了生物體在生長發(fā)育過程中，能夠根據(jù)需要及時調(diào)整蛋白質(zhì)的合成，從而適應(yīng)不斷變化的環(huán)境。細(xì)菌mRNA的平均半衰期約為1.5分鐘，而脊椎動物mRNA的半衰期則差異較大，平均約為3小時。一個完整的mRNA包括5'端帽、5'非翻譯區(qū)、編碼區(qū)、3'非翻譯區(qū)和poly(A)尾鏈。
RNA分離方法
從生物樣本中分離 RNA 通常采用提取方法，利用 RNA 和 DNA 之間的差異以及細(xì)胞成分的物理特性。其基本原理是破碎細(xì)胞以釋放 RNA，然后將 RNA 與 DNA、蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞碎片分離。最常用的 RNA 分離技術(shù)包括：有機溶劑萃?。═RIzol法），硅膠柱純化試劑盒，基于磁珠的RNA分離。
與DNA不同，RNA是極為脆弱的，由于其單鏈結(jié)構(gòu)，RNA的堿基和氫鍵全都暴露在環(huán)境中，極易被環(huán)境中的各種化學(xué)物質(zhì)和RNA酶降解。一旦降解，后期的實驗純屬浪費時間了，然而這一過程往往是不易察覺。
如何判斷從樣本提取RNA質(zhì)量，主要從完整性、純度和濃度三個維度進(jìn)行評估，這是確保后續(xù)實驗（如qPCR、RNA-seq等）成功的關(guān)鍵步驟
一、RNA完整性檢測：判斷是否降解
完整性反映RNA是否被RNase降解，常用以下方法：
1.瓊脂糖凝膠電泳（推薦）
●真核生物總RNA應(yīng)顯示清晰的28S和18S rRNA條帶，且28S條帶亮度約為18S的1.5–2倍。
●若條帶模糊、彌散或比例失衡（如28S明顯弱于18S），提示RNA已降解。
●5S rRNA條帶較弱，通常也能觀察到。
●注意：mRNA在電泳圖中表現(xiàn)為28S與18S之間的彌散背景，不屬于降解。
圖中的條帶從上到下分別為28S、18S、5S，這是真核生物的特征。28S和18S 條帶最明亮、清晰、條帶邊緣銳利，最重要的是28S條帶的亮度大概是18S條帶的兩倍或者以上，這種情況RNA的質(zhì)量是很好的
二、RNA純度檢測：評估污染物殘留
使用紫外分光光度計（如NanoDrop）測量吸光度比值：
●A260/A280 比值：評估蛋白質(zhì)污染
●理想值為1.8–2.1，接近2.0為佳。
●<1.8 提示蛋白質(zhì)或酚類殘留；>2.1 可能表示RNA部分水解。
●A260/A230 比值：評估有機溶劑、鹽類或碳水化合物污染
●正常值應(yīng)>1.8–2.0，低于此值提示存在胍鹽、酚或糖類污染。
●280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、鹽濃度和蛋白等有機物的值。我們只看OD260/OD280。理論上，純RNA情況下的OD260/OD280的值為2，可接受的范圍為1.8-2.0。純的DNA情況下的OD260/OD280的值為1.8，可接受的范圍是1.6-1.8。一般認(rèn)為RNA中的蛋白或是其他有機物的污染是可以接受的，當(dāng)R<1.8時，溶液中蛋白或是酚類物質(zhì)殘留。當(dāng)R>2.2時，說明RNA已經(jīng)水解為單核酸。一般的，如果你能做到1.9-2.0之間，說明RNA純度已經(jīng)很高了。但是如果你采用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會＞2(一般應(yīng)＜2.2的)。
三、RNA濃度檢測：確定可用量
1.紫外分光光度法（快速但易受干擾）
●利用A260吸光值計算濃度：RNA濃度(μg/mL)=A260×40×稀釋倍數(shù)RNA濃度(μg/mL)=A260×40×稀釋倍數(shù)（1個A260單位相當(dāng)于約40 μg/mL RNA）。
2.熒光染料法（更準(zhǔn)確，推薦用于微量樣本）
●使用Qubit等熒光定量儀配合特異性RNA染料（如RiboGreen）
●優(yōu)勢：不受DNA、蛋白質(zhì)或鹽類干擾，靈敏度更高，適合低濃度樣品。
判斷RNA是否被酶（主要指RNase）污染，是分子生物學(xué)實驗質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟。RNA極易被無處不在的RNase降解，導(dǎo)致下游實驗（如RT-qPCR、RNA-seq）失敗。
上面幾種方法都是采用物理的方法進(jìn)行檢測，但是我們無法得知所抽提的RNA是否有RNA酶污染。RNA酶比較頑強，單純加溫也很難滅活，必須使用DEPC。實驗室環(huán)境中其實存在很多RNA酶，這些酶大多來源于人的呼吸和唾沫。你可以保證自己帶口罩實驗，但是你可能很難要求同處一室的其他人都帶上口罩。很多高質(zhì)量的實驗室會開通PCR專用實驗間，他們的實驗往往比較順利。
RNA保溫試驗（Incubation Test）
1.將同一RNA樣本分裝兩份。
2.一份置于37°C或室溫（如25°C）下保溫30-60分鐘，另一份置于冰上或-20°C保存作為對照。
3.保溫結(jié)束后，將兩份樣本同時進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
●結(jié)果判斷：如果保溫樣本的電泳圖譜出現(xiàn)明顯降解（如28S條帶減弱、smear增加），而對照樣本完好，則強烈證明樣本中存在活躍的RNase污染。
●下游酶反應(yīng)失敗：如果RNA樣本在后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄（RT）或體外轉(zhuǎn)錄等實驗中效率極低或完全失敗，而實驗體系對照正常，也高度提示RNA可能已降解或含有酶抑制劑。
問題排查
如果懷疑或確認(rèn)RNA被RNase污染，請按以下步驟排查：
1.檢查電泳圖譜：確認(rèn)降解模式（部分或完全降解）。
2.回顧提取過程：使用的試劑、耗材是否均為無RNase？是否全程在冰上操作？
3.檢查儲存條件：RNA是否在-80°C長期保存？避免反復(fù)凍融，建議分裝儲存。
4.進(jìn)行保溫試驗：確認(rèn)污染是否來自樣本本身。
5.設(shè)置陽性對照：在下次提取時，使用已知完好的細(xì)胞/組織樣本作為對照，同步提取并電泳，以判斷是樣本問題還是操作體系問題。
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